Khi nghiên cứu các chất trong hóa học hữu cơ, hơn chục phản ứng định tính khác nhau được sử dụng để xác định hàm lượng của một số hợp chất nhất định. Phân tích trực quan như vậy cho phép bạn ngay lập tức hiểu liệu các chất cần thiết có hiện diện hay không và nếu chúng không có mặt, bạn có thể giảm đáng kể các thí nghiệm tiếp theo để xác định chúng. Những phản ứng này bao gồm ninhydrin, là phản ứng chính trong việc xác định trực quan các hợp chất amin.
Đây là gì?
Ninhydrin là một hợp chất dicarbonyl chứa một vòng thơm với một dị vòng gắn với nó, nguyên tử thứ hai của chúng có 2 nhóm hydroxyl (OH-). Chất này thu được bằng cách oxy hóa trực tiếp inandione - 1, 3, và do đó, theo danh pháp quốc tế, nó có tên như sau: 2, 2 - dihydroxyinandione -1, 3 (Hình 1).
Ninhydrin nguyên chất là tinh thể màu vàng hoặc trắngMàu sắc mà khi đun nóng, hòa tan tốt trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, chẳng hạn như axeton. Đây là một chất khá độc hại, nếu nó tiếp xúc với da với số lượng lớn hoặc niêm mạc, nó sẽ gây kích ứng, kể cả khi hít phải. Làm việc với hợp chất này nên cẩn thận và chỉ với găng tay, vì khi nó tiếp xúc với da, nó sẽ phản ứng với các protein của tế bào da và làm cho nó có màu tím.
Chất phản ứng
Như đã đề cập ở trên, phản ứng ninhydrin được sử dụng chủ yếu để xác định trực quan hàm lượng của các hợp chất amin:
- α-amino axit (bao gồm cả trong protein);
- đường amin;
- ancaloit chứa nhóm –NH2và -NH;
- amin khác nhau.
Cần lưu ý rằng các amin bậc hai và bậc ba đôi khi phản ứng rất yếu, vì vậy cần phải nghiên cứu thêm để xác nhận sự hiện diện của chúng.
Các phương pháp sắc ký khác nhau được sử dụng để xác định định lượng, ví dụ, sắc ký giấy (BC), sắc ký lớp mỏng (TLC) hoặc rửa chất mang rắn bằng dung dịch ninhydrin trong các môi trường khác nhau.
Phản ứng này không dành riêng cho các hợp chất amin, vì thuốc thử có thể xâm nhập vào nó cùng một lúc. Tuy nhiên, về một phần của các sản phẩm phản ứng, nó có một điểm đặc biệt là ở dạng giải phóng bọt khí carbon dioxide (CO2), và điều này chỉ xảy ra khi tương tác với α-amino. axit.
Tính năng cơ chế
BCó nhiều cách giải thích khác nhau về phương trình phản ứng ninhydrin trong tài liệu. Một số nhà nghiên cứu bỏ qua sự hình thành hydrindanthine từ 2-aminoinandione, với sự tham gia của amoniac và ninhydrin, cũng tạo thành một chất tạo màu được gọi là "màu tím của Rueman" (hoặc "màu xanh của Rueman"), trong khi những người khác, ngược lại, chỉ cho rằng nó tham gia mà không có sự hiện diện của các sản phẩm amin trung gian. Cũng có một số điểm thú vị trong hồ sơ về phản ứng, đặc biệt, điều này liên quan đến các phương pháp gắn dẫn xuất amin của ninhydrin với phân tử chính của nó để tạo thành thuốc nhuộm. Dấu hiệu về vị trí của “hydro đi bộ” thu được bởi amin trung gian từ môi trường nước cũng còn nhiều nghi vấn: nó có thể nằm trong nhóm xeton hoặc bên cạnh –NH2.
Trong thực tế, sắc thái với nguyên tử H là không đáng kể, vì vị trí của nó trong hợp chất không có vai trò đặc biệt trong quá trình phản ứng nên không cần chú ý. Đối với việc bỏ sót một trong những giai đoạn có thể xảy ra, lý do ở đây nằm ở khía cạnh lý thuyết: cho đến nay, cơ chế chính xác hình thành màu tím của Rueman vẫn chưa được xác định chính xác, vì vậy có thể tìm thấy các sơ đồ phản ứng ninhydrin khá khác nhau.
Quá trình tương tác đầy đủ nhất có thể có của thuốc thử với các hợp chất amin sẽ được đề xuất bên dưới.
Cơ chế phản ứng
Đầu tiên, ninhydrin tương tác với axit α-amino, gắn nó tại vị trí phân cắt các nhóm hydroxy và tạo thành sản phẩm ngưng tụ (Hình 2a). Sau đó, chất thứ hai bị phá hủy, giải phóng amin trung gian, aldehyde và carbon dioxide (Hình 2b). Từ sản phẩm cuối cùng khi tham gianinhydrin, cấu trúc màu tím Rueman (diketonhydrindenketohydrinamine, Hình 2c) được tổng hợp. Cũng được chỉ ra là có thể tạo thành hydrindanthine (ninhydrin khử) từ amin trung gian, cũng biến thành hợp chất tạo màu khi có mặt amoniac (chính xác hơn là amoni hydroxit) với lượng dư của chính thuốc thử (Hình 2d).
Sự tạo thành hydrindantine đã được chính Rueman chứng minh khi hydro sunfua tác dụng lên phân tử ninhydrin. Hợp chất này có thể tan trong natri cacbonat Na2CO3, tạo màu cho dung dịch là màu đỏ sẫm. Và khi thêm axit clohydric loãng vào, hydrindanthine sẽ kết tủa.
Rất có thể, amin trung gian, hydridanthin, ninhydrin và cấu trúc của thuốc nhuộm, do tính không ổn định của chúng khi đun nóng, ở một số trạng thái cân bằng, điều này cho phép sự hiện diện của một số giai đoạn bổ sung.
Cơ chế này thích hợp để giải thích phản ứng ninhydrin với các hợp chất amin khác, ngoại trừ các sản phẩm phụ do loại bỏ phần còn lại của cấu trúc khỏi –NH2, -NH hoặc -N.
Thử nghiệm Biuret và các phản ứng khác với protein
Phân tích định tính cho các liên kết peptit thậm chí của các cấu trúc không phải protein có thể diễn ra không chỉ với sự tham gia của thuốc thử trên. Tuy nhiên, trong trường hợp phản ứng ninhydrin với protein, tương tác không diễn ra dọc theo nhóm –CO-NH‒, mà ở nhóm amin. Có một cái gọi là "phản ứng biuret", được đặc trưng bởi sự bổ sung các ion vào dung dịch với các hợp chất aminđồng hóa trị từ CuSO4hoặc Cu (OH)2trong môi trường kiềm (Hình 3).
Trong quá trình phân tích, khi có mặt các cấu trúc cần thiết, dung dịch chuyển sang màu xanh lam đậm do liên kết peptit liên kết thành một phức chất màu, giúp phân biệt thuốc thử này với thuốc thử khác. Đó là lý do tại sao phản ứng biuret và ninhydrin phổ biến liên quan đến cấu trúc protein và phi protein với nhóm –CO-NH‒.
Khi xác định axit amin mạch hở, người ta dùng phản ứng xantoprotein với dung dịch axit nitric đặc HNO3, khi nitro hóa sẽ có màu vàng. Một giọt thuốc thử trên da cũng có màu vàng do phản ứng với các axit amin trong tế bào da. Axit nitric có thể gây bỏng và cũng cần được xử lý bằng găng tay.
Ví dụ về tương tác với các hợp chất amin
Ninhydrin phản ứng tạo ra các α-amino axit cho kết quả hình ảnh tốt, ngoại trừ cấu trúc proline và hydroxyproline tạo màu, phản ứng tạo ra màu vàng. Có thể giải thích cho hiệu ứng này trong các điều kiện môi trường khác về sự tương tác của ninhydrin với các cấu trúc này.
Phản ứng với nhóm amin
Vì thử nghiệm không cụ thể nên không thể phát hiện bằng mắt alanin bằng phản ứng ninhydrin trong hỗn hợp. Tuy nhiên, bằng phương pháp sắc ký giấy, khi áp dụng các mẫu gồm nhiều α-amino axit khác nhau, phun chúng bằng dung dịch nước ninhydrin và phát triển trong môi trường đặc biệt, người ta có thểtính toán thành phần định lượng của không chỉ hợp chất được công bố mà còn của nhiều hợp chất khác.
Về mặt sơ đồ, tương tác của alanin với ninhydrin tuân theo nguyên tắc tương tự. Nó gắn vào thuốc thử ở nhóm amin, và dưới tác dụng của các ion hydronium hoạt động (H3O+) bị tách ra ở cacbon -nitrogen liên kết, phân hủy thành acetaldehyde (CH3COH) và carbon dioxide (CO2). Một phân tử ninhydrin khác gắn với nitơ, thay thế các phân tử nước và cấu trúc màu được hình thành (Hình 4).
Phản ứng với hợp chất amin dị vòng
Phản ứng ninhydrin với proline là đặc trưng, đặc biệt là trong phân tích sắc ký, vì cấu trúc như vậy trong môi trường axit đầu tiên chuyển sang màu vàng, sau đó chuyển sang màu tím trong môi trường trung tính. Các nhà nghiên cứu giải thích điều này bằng một đặc điểm của sự sắp xếp lại chu trình trong hợp chất trung gian, hợp chất này bị ảnh hưởng chính xác bởi sự hiện diện của một số lượng lớn các proton hydro bổ sung cho mức năng lượng bên ngoài của nitơ.
Sự phá hủy dị vòng không xảy ra và một phân tử ninhydrin khác được gắn vào nó ở nguyên tử cacbon thứ 4. Khi đun nóng thêm, cấu trúc tạo thành trong môi trường trung tính chuyển thành màu tím Rueman (Hình 5).
Chuẩn bị thuốc thử chính
Thử nghiệm Ninhydrin được thực hiện với các dung dịch khác nhau, tùy thuộc vào sự hòa tan của các cấu trúc amin trong một số chất hữu cơ vàhợp chất vô cơ.
Thuốc thử chính là chuẩn bị dung dịch 0,2% trong nước. Đây là một hỗn hợp đa năng, vì hầu hết các hợp chất đều hòa tan tốt trong H2O. Để thu được thuốc thử mới chuẩn bị, một mẫu gồm 0,2 g ninhydrin tinh khiết về mặt hóa học được pha loãng trong 100 ml nước.
Cần lưu ý rằng đối với một số dung dịch đã phân tích thì nồng độ này không đủ, vì vậy có thể pha chế dung dịch 1% hoặc 2%. Đây là đặc điểm điển hình cho chiết xuất từ nguyên liệu làm thuốc, vì chúng chứa nhiều loại hợp chất amin khác nhau.
Khi tiến hành nghiên cứu sắc ký, các dung dịch, ví dụ, khi rửa hỗn hợp trên chất mang rắn qua cột, có thể được chuẩn bị trong rượu, dimetyl sulfoxit, axeton và các dung môi phân cực khác - mọi thứ sẽ phụ thuộc vào dung môi của một số cấu trúc amin.
Đơn
Phản ứng ninhydrin giúp phát hiện nhiều hợp chất amin trong dung dịch, đây là một trong những phản ứng đầu tiên được sử dụng trong phân tích định tính các chất hữu cơ. Việc xác định bằng mắt thường làm giảm đáng kể số lượng thí nghiệm, đặc biệt là khi phân tích các loại thực vật, thuốc và dạng bào chế được nghiên cứu kém, cũng như các dung dịch và hỗn hợp chưa biết.
Trong khoa học pháp y, phương pháp này được sử dụng rộng rãi để xác định sự hiện diện của các vết mồ hôi trên bất kỳ bề mặt nào.
Ngay cả khi phản ứng không đặc hiệu, việc rút phản ứng ninhydrin khỏi thực hành hóa học là không thể, vìthay thế chất này bằng các chất tương tự ít độc hơn (ví dụ, oxolin) đã chứng minh rằng chúng có độ nhạy kém hơn với các nhóm amin và không cho kết quả tốt trong phân tích trắc quang.
