Nuôi cấy vi khuẩn: phương pháp, nguyên tắc, bước và điều kiện

2024 Tác giả: Angel Austin | [email protected]. Sửa đổi lần cuối: 2023-12-17 05:46

Vi sinh vật trong tự nhiên xung quanh chúng ta có ở khắp mọi nơi: trong đất, nước, trên bề mặt của các đồ vật khác nhau, con người và động vật là nơi sinh sống của chúng. Tất cả những điều này có thể là nguồn gây ô nhiễm vi sinh vật đối với thực phẩm, thuốc và dây chuyền sản xuất. Việc nuôi cấy vi khuẩn là cần thiết để nghiên cứu các đặc tính, nhu cầu và đặc điểm của chúng. Đến lượt nó, đây là một bước quan trọng trong việc phát triển các loại thuốc khác nhau, chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm, tính toán các lò phản ứng sản xuất và hơn thế nữa.

Khái niệm chung

Nuôi cấy vi khuẩn trong vi sinh đề cập đến việc nuôi cấy vi sinh vật được thực hiện trong phòng thí nghiệm. Đổi lại, vi sinh đã phát triển trên môi trường dinh dưỡng đã chọn được gọi là môi trường nuôi cấy. Các chất nuôi cấy có thể được trộn lẫn nếu chúng được hình thành bởi các loại vi sinh vật khác nhau và tinh khiết nếu chúng chỉ được đại diện bởi một loại vi khuẩn.

Nếu dinh dưỡngChỉ một tế bào được đặt trong môi trường và một nhóm cá thể thu được do quá trình sinh sản của nó, khi đó tập hợp vi sinh vật này được gọi là dòng vô tính. Khi một bản sao phát triển đến mức có thể nhìn thấy bằng mắt thường, tập hợp vi khuẩn này được gọi là khuẩn lạc.

Thông thường việc nuôi cấy vi khuẩn được phân lập từ các nguồn khác nhau được thực hiện riêng biệt với nhau. Mỗi nhóm vi sinh được phát triển riêng biệt như vậy được gọi là một chủng. Vì vậy, nếu một loại tụ cầu được phân lập từ ba nguồn (hoặc các phần khác nhau của cùng một sản phẩm, những người khác nhau), họ sẽ nói về ba chủng của loại tụ cầu này.

Yếu tố tăng trưởng vi khuẩn

Chúng bao gồm các axit amin khác nhau, lipid, bazơ purine và các hợp chất khác cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật. Một số vi khuẩn có thể sản xuất độc lập các chất chúng cần, trong khi những vi khuẩn khác cần tiếp nhận chúng ở dạng thành phẩm. Theo nhu cầu của vi sinh vật trong các yếu tố sinh trưởng nhất định, việc xác định và phân biệt vi khuẩn được thực hiện. Ngoài ra, thông số này rất quan trọng đối với việc chuẩn bị chính xác môi trường dinh dưỡng cho công việc trong phòng thí nghiệm và công nghệ sinh học:

Axit amin. Vi khuẩn có thể yêu cầu một loại axit amin hoặc một nhóm axit cụ thể. Vì vậy, clostridia cần leucine và tyrosine, liên cầu cần leucine và arginine. Các vi sinh vật cần axit amin từ bên ngoài để phát triển được gọi là sinh vật hỗ trợ.
Các gốc purine và pyrimidine, cũng như các dẫn xuất của chúng (adenine, guanine và những chất khác). Chúng là một yếu tố quan trọng trong sự phát triển của nhiềuCác loài liên cầu.
Vitamin. Chúng là một phần của coenzyme mà vi khuẩn yêu cầu. Vì vậy, axit nicotinic, cũng như amit của nó, là một phần của NAD và NADP, cần thiết cho vi khuẩn bạch hầu và vi khuẩn shigella corynebacteria. Thiamine, như một phần không thể thiếu của pyrophosphate, được yêu cầu bởi Staphylococcus aureus, phế cầu, brucella. Axit pantothenic, là một phần của coenzyme CoA, được yêu cầu bởi trực khuẩn uốn ván và một số loại liên cầu. Các cytochromes, và do đó axit folic, hemes và biotin tạo thành chúng, cần thiết cho Mycobacterium tuberculosis và Haemophilus influenzae.

Yêu cầu về Môi trường

Điều kiện môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

Dinh dưỡng. Hơn nữa, chúng phải chứa các chất, ở dạng dễ tiêu hóa, cần thiết cho vi sinh vật kiếm ăn và bổ sung năng lượng. Chúng bao gồm các chất hữu cơ và khoáng chất. Một số vi sinh vật cần bổ sung vitamin và axit amin mà chúng không thể tổng hợp được.
Độ pH tối ưu. Nó ảnh hưởng đến tính thấm của màng tế bào và do đó, khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của vi khuẩn. Thông thường, giá trị pH phải ở mức 7, 2–7, 4. Nhiều vi sinh vật trong quá trình sống của chúng tạo ra các sản phẩm có phản ứng axit hoặc kiềm, và để pH của môi trường dinh dưỡng không thay đổi, nó phải được đệm.
Isotonic. Áp suất thẩm thấu trong môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi khuẩn phải có cùng giá trịbên trong tế bào vi sinh vật. Nó thường tương ứng với dung dịch NaCl 0,5%.
Vô trùng. Điều này là do sự xuất hiện của vi khuẩn ngoại lai sẽ làm sai lệch kết quả nghiên cứu chủng phân tích.
Mức độ ẩm. Chỉ số này, cùng với tính nhất quán của môi trường, nên có các đặc tính tối ưu cho một loại vi khuẩn cụ thể.
Thế oxi hóa khử (RH2). Nó cho thấy tỷ lệ của các chất cho và nhận electron, cũng như mức độ bão hòa oxy của môi trường dinh dưỡng. Đối với vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí, điều kiện nuôi cấy vi khuẩn có phần khác nhau về chỉ tiêu này. Vi sinh vật kỵ khí sinh sản tốt nhất ở giá trị RH2 dưới 5 và vi sinh vật hiếu khí ít nhất là 10.
Đồng nhất. Điều quan trọng là môi trường nuôi cấy phải chứa một lượng không đổi các thành phần riêng lẻ của nó. Ngoài ra, các giải pháp rõ ràng được ưu tiên hơn, giúp theo dõi sự phát triển của cây trồng hoặc nhận thấy sự ô nhiễm dễ dàng hơn.

Các loại môi trường nuôi cấy

Việc lựa chọn một môi trường cụ thể để nuôi cấy vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, trong đó có đặc điểm dinh dưỡng của chúng và mục đích của nghiên cứu. Các đặc điểm chính cơ bản của việc phân loại môi trường dinh dưỡng là:

1. Các thành phần. Theo các chất ban đầu được sử dụng để tạo nền, chúng phân biệt:

tự nhiên, được chế biến từ các sản phẩm có nguồn gốc động vật hoặc thực vật (ví dụ: thịt, sữa, trái cây) và thích hợp để trồng hỗn hợpcây trồng;
bán tổng hợp, trong đó các sản phẩm thực phẩm tự nhiên đắt tiền được thay thế bằng các sản phẩm không phải thực phẩm (ví dụ: bột xương, cục máu đông) và là sản phẩm tối ưu để nuôi cấy một số loại vi khuẩn hoặc cô lập các sản phẩm chuyển hóa của chúng khỏi môi trường;
tổng hợp, được điều chế từ lượng hợp chất hóa học chính xác, có thành phần không đổi đã biết và có thể tái tạo dễ dàng.

2. Tính nhất quán (mật độ). Phân biệt các môi trường:

lỏng;
đặc;
bán lỏng.

Hai loại cuối cùng được chuẩn bị từ các dung dịch đặc biệt hoặc các chất lỏng có bổ sung agar-agar hoặc gelatin để tạo ra tỷ trọng theo yêu cầu. Ngoài ra, một môi trường dày đặc cho sự phát triển của vi khuẩn là huyết thanh đông máu, khoai tây, môi trường silica gel, carrageenan.

3. Hợp chất. Trên cơ sở này, các môi trường là:

đơn giản, danh sách trong đó ngắn gọn là Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), gelatin dinh dưỡng và nước peptone.
phức tạp, được chế biến từ những thứ đơn giản với sự bổ sung của máu, whey, carbohydrate và các chất khác.

4. Cuộc hẹn. Các môi trường dinh dưỡng sau được phân biệt:

chính được sử dụng để nuôi nhiều vi khuẩn gây bệnh (thường là thành phần đơn giản);
đặc biệt được sử dụng để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn không phát triển trên chất nền đơn giản;
chọn lọc (chúng cũng có tính chọn lọc) thích hợp để phân lập một loại vi khuẩn cụ thể và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn liên quan (tính chọn lọcđược tạo ra bằng cách thêm một số chất nhất định vào môi trường, chẳng hạn như kháng sinh hoặc muối hoặc bằng cách điều chỉnh độ pH);
chẩn đoán phân biệt giúp bạn có thể phân biệt một loại vi khuẩn này với một loại vi khuẩn khác bằng cách đánh giá hoạt tính của enzym, ví dụ: của môi trường;
chất bảo quản là cần thiết cho quá trình cấy ban đầu khi vận chuyển mẫu tiếp theo, vì chúng ngăn chặn cái chết của vi sinh vật, cũng như ức chế sự phát triển của các vi khuẩn khác.

Chuẩn bị phương tiện

Bước quan trọng nhất trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí là chuẩn bị môi trường dinh dưỡng phù hợp. Sau khi các thông số tối ưu được chọn, tiến hành các bước sau:

cân, bằng cách chọn một mẫu thành phần trên cân phân tích;
hòa tan được thực hiện trong nước cất được làm nóng đến 70 ° C, và phốt phát, vi và macro được hòa tan riêng biệt;
đun sôi trong nồi cách thủy hai phút;
xác định độ pH bằng giấy chỉ thị hoặc chiết áp;
lọc qua vải ướt hoặc bộ lọc giấy cho chất lỏng cũng như môi trường đặc nóng chảy, và qua bộ lọc bông gạc cho môi trường thạch;
đóng chai được thực hiện trên 3/4 công suất;
tiệt trùng phụ thuộc trung bình;
kiểm soát độ vô trùng được thực hiện bằng cách để hai ngày trong máy điều nhiệt, sau đó là xem;
kiểm soát hóa học để thiết lập độ pH và hàm lượng cần thiếtmặt hàng;
kiểm soát sinh học bằng cách cấy thử nghiệm.

Tiệt trùng dụng cụ thủy tinh và phương tiện

Một trong những nguyên tắc cơ bản của việc nuôi cấy vi khuẩn là vô trùng. Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ngoại lai có thể ảnh hưởng đến các đặc tính của môi trường dinh dưỡng bằng cách thay đổi thành phần hóa học và độ pH của nó. Tiệt trùng là điều kiện chính để nuôi cấy thuần chủng. Trong thực tế, thuật ngữ này có nghĩa là các phương pháp tiêu diệt hoàn toàn tất cả các dạng sống trên bề mặt và trong khối lượng của các vật thể đã được khử trùng. Các bình, dụng cụ được sử dụng, phương tiện truyền thông và các vật dụng khác được sử dụng trong quá trình nghiên cứu đều được khử trùng.

Một số kiểu tiệt trùng:

Đánh lửa. Khử trùng vòng và kim để cấy giống, lam kính, một số dụng cụ có thể được thực hiện bằng đèn đốt hoặc đèn thần.
Sôi. Thích hợp để xử lý ống tiêm, kim tiêm, thực phẩm, nhưng không diệt được bào tử vi khuẩn.
Khử trùng bằng nhiệt khô. Nó được thực hiện trong một tủ sấy khô đặc biệt và thích hợp để xử lý bình, ống nghiệm và các dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm khác.
Tiệt trùng bằng hơi nước. Thực hiện trong nồi hấp, phương pháp này mang lại hiệu quả cao. Nhưng nó không thích hợp với môi trường dinh dưỡng có chứa protein hoặc bất kỳ hợp chất nào khác bị phân hủy ở nhiệt độ cao. Tiết kiệm hơn có thể được gọi là tyndalization. Nó được thực hiện trong Koch Boiler và kết hợp sự nảy mầm của bào tử với việc tiêu diệt chúng.
Thanh trùng. Nó được sử dụng cho môi trường thay đổi đặc tính của chúng khi đun sôi (ví dụ, sữa, rượu, bia), có khả năngloại bỏ chúng khỏi các vi sinh vật không mang bào tử. Nhiệt độ xử lý chỉ là 50-60 ° C trong vòng mười lăm đến ba mươi phút. Trong một số trường hợp, khử trùng lạnh được sử dụng, được thực hiện bằng bộ lọc hoặc tia UV.

Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn

Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn chỉ có thể xảy ra dưới một số yếu tố nhất định và giá trị của từng yếu tố đó:

1. Nhiệt độ. Có ba nhóm vi khuẩn khác nhau về tùy chọn nhiệt độ:

vi khuẩn ưa nhiệt, hoặc vi sinh vật ưa nhiệt, phát triển ở 45-90 ° C, có nghĩa là chúng không sinh sôi trong cơ thể người và động vật;
psychrophiles, hay vi sinh vật ưa lạnh, thích nhiệt độ trong khoảng 5-15 ° C và được nuôi trong kho lạnh;
mesophiles, phát triển ở nhiệt độ 25-37 ° C, chúng bao gồm số lượng lớn vi khuẩn.

2. Nhẹ. Đó là một đặc điểm của việc nuôi cấy vi khuẩn quang dưỡng, vì chúng thực hiện quá trình quang hợp. Nhưng đối với hầu hết các vi khuẩn, ánh sáng không phải là điều kiện tiên quyết. Và thậm chí ngược lại, tia cực tím mặt trời có thể ngăn chặn sự phát triển của chúng.

3. Nước. Tất cả các vi sinh vật cần nước ở dạng (lỏng) có thể tiếp cận được. Đó là lý do tại sao thực phẩm đông lạnh có rất ít hoặc không có vi khuẩn phát triển.

4. Tính axit của môi trường. Nguyên tắc nuôi cấy vi khuẩn này đã được thảo luận chi tiết ở trên.

5. Sục khí. Oxy, như một nguyên tố hóa học, là một phần không thể thiếu của nước và một số lượng đáng kể các hợp chất được sử dụng chonuôi cấy vi sinh vật. Khí oxy cũng có thể được chứa trong nước và các chất lỏng khác ở dạng hòa tan. Một phần đáng kể vi khuẩn cần được cung cấp liên tục các phân tử oxy. Nhưng đối với một số vi sinh vật, ôxy thể khí là không cần thiết, hoặc tệ hơn là độc hại đối với chúng, vì chúng không có catalase và peroxidase, những chất này phá hủy các sản phẩm hô hấp độc hại. Do đó, bước quan trọng nhất trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí là loại bỏ các phân tử O₂khỏi môi trường dinh dưỡng.

6. Nuôi cấy vi sinh vật. Việc nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí được thực hiện trong các tầng khác nhau của môi trường và ở các chế độ khác nhau.

Nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí

Nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí cần oxy phân tử. Để thu được các vi khuẩn hiếu khí thuần khiết có thể được sử dụng thành công trong y học và công nghiệp thực phẩm, các phương pháp sau được sử dụng:

bề mặt phát triển trên môi trường dày đặc hoặc trong môi trường lỏng (lớp mỏng của chúng) khi oxy đến trực tiếp từ không khí;
nuôi cấy sâu trong môi trường lỏng, khi tăng lượng oxy hòa tan trong chúng bằng cách sục khí liên tục.

Nuôi cấy vi sinh kỵ khí

Nguyên tắc cơ bản của việc nuôi cấy loại vi khuẩn này là chúng tiếp xúc tối thiểu với oxy trong khí quyển. Cung cấp các điều kiện cho sự phát triển của chúng khó hơn nhiều so với các loài hiếu khí. Các phương pháp sau được sử dụng để phân lập vi khuẩn kỵ khí từ phân tử O₂:

Thể chất. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí này được rút gọn thành việc nuôi cấy chúng trong một thiết bị chân không đặc biệt - microanaerostat. Không khí trong đó được thay thế bằng hỗn hợp khí nitơ đặc biệt với việc bổ sung 10% hydro và 5% carbon dioxide.
Hóa chất. Chúng bao gồm: sử dụng các chất hấp thụ (ví dụ: Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) hoặc các chất khử (chẳng hạn như axit ascorbic).
Sinh học. Nó phụ thuộc vào việc đồng nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí trong một hệ thống khép kín. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn này bao gồm việc gieo một nửa đĩa Petri với một số loài vi khuẩn hiếu khí và nửa còn lại với vi khuẩn kỵ khí đã được nghiên cứu. Sự phát triển của nó sẽ bắt đầu vào thời điểm khi tất cả oxy được sử dụng hết.

Các phương pháp gieo hạt sau đây thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí:

ở lớp bề mặt;
ở lớp bề mặt chứa đầy parafin vô trùng;
trong môi trường dinh dưỡng dày đặc;
trong lớp sâu của môi trường nhớt.

Có được văn hóa thuần túy

Các nhà vi sinh vật học thường làm việc với các mẫu là nơi sinh sống của nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Tuy nhiên, để xác định vị trí hệ thống của vi sinh vật (họ, chi, loài), cũng như nghiên cứu các đặc tính của chúng, cần phải phân lập chúng và nuôi cấy thuần. Chúng có tầm quan trọng lớn trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, ví dụ như pho mát, bánh mì, kvass, rượu vang, v.v. Việc nuôi cấy vi khuẩn axit lactic giúp thu đượcmột thành phần thiết yếu để sản xuất các sản phẩm sữa lên men, bột nhào, ca cao, thức ăn ủ chua và thậm chí cả nhựa.

Phương pháp phân lập mẫu cấy thuần khiết trong môi trường đậm đặc dựa trên sự phân tách cơ học của các tế bào vi sinh vật với quá trình nuôi cấy phân lập tiếp theo của chúng. Mẫu được chuyển vào một thể tích nước hoặc nước muối vô trùng (thể tích 10-100 ml) và sau đó lắc trong hai phút. Để tách các vi sinh vật nằm trong độ dày của vật liệu đang nghiên cứu (ví dụ, xúc xích hoặc pho mát), trước tiên, thực hiện chà xát các mẩu mẫu bằng dụng cụ vô trùng với cát. Nguyên liệu đã qua sơ chế, có trọng lượng 1 g hoặc 1 ml, được pha loãng với nước vô trùng 10, 100, 1000, v.v. lần. Mức độ pha loãng được chọn để tạo ra nồng độ tế bào tương ứng với khả năng của phương pháp.

Việc nuôi cấy vi sinh vật tiếp theo là chuẩn bị môi trường dinh dưỡng. Thường chọn môi trường đậm đặc (MPA). Đầu tiên, nó được nấu chảy và làm lạnh đến 45-50 ° C, và chỉ sau đó nó được đổ vào một số đĩa Petri (ba đến năm miếng), trên đáy có đặt các miếng gạc từ chất thử với các nồng độ khác nhau. Tiếp theo, tiến hành trộn môi trường dinh dưỡng vẫn chưa đông và nguyên liệu đưa vào. Đây là cách các ô được cố định tại các điểm khác nhau trong thể tích của chất nền.

Tiếp theo, các đĩa Petri được đặt trong máy điều nhiệt trong 2 ngày ở 22 ° C. Trong thời gian này, các tế bào nhân lên đến mức khuẩn lạc được tạo thành bởi mỗi tế bào có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Mỗi người trong số họ là một nền văn hóa thuần túy của loại vi khuẩn từ tế bào của chúnghoa hồng.

Sau đó, từ đĩa Petri, vi sinh vật được cấy vào các ống nghiệm riêng chứa đầy môi trường dinh dưỡng. Bằng cách này, các mẫu cấy tinh khiết được phân lập từ một mẫu hỗn hợp. Phương pháp này mang tên của người phát triển nó - R. Koch. Nó cũng thường được gọi là phương pháp tách, hoặc gieo hạt cạn kiệt. Sau khi thu được các nền văn hóa thuần túy của nhiều loại vi khuẩn khác nhau, hình dạng, bào tử và họ của chúng sẽ được xác định.

Mọi công việc phải được thực hiện theo nguyên tắc vô trùng. Để tránh sự phát triển sớm của vi sinh vật, nghiên cứu nên được thực hiện ngay sau khi lấy mẫu. Nước máy được phân tích sau khi xả hết phần đầu tiên, vì chúng có thể chứa vi khuẩn tích tụ trong đường ống và vòi. Hệ vi sinh của trái cây, quả mọng và rau chủ yếu nằm trên bề mặt (vỏ), do đó, quá trình rửa được thực hiện từ nó. Để làm điều này, hãy đặt thai nhi vào một hộp đựng vô trùng và đổ đầy nước vào nó. Sau đó, chúng được lắc khá mạnh và nước được đổ vào một thùng chứa khác. Cây trồng từ các sản phẩm vải cũng được lấy bằng gạc, nhưng trước đó, các mảnh có kích thước nhất định sẽ được cắt ra từ chúng.