Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử đóng một vai trò lớn trong y học hiện đại, pháp y và sinh học. Nhờ những tiến bộ trong nghiên cứu DNA và RNA, một người có thể nghiên cứu bộ gen của một sinh vật, xác định tác nhân gây bệnh, nhận ra axit nucleic mong muốn trong hỗn hợp axit, v.v.
Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử. Nó là gì?
Quay lại những năm 70 và 80, lần đầu tiên các nhà khoa học đã thành công trong việc giải mã bộ gen người. Sự kiện này đã tạo động lực cho sự phát triển của công nghệ gen và sinh học phân tử. Việc nghiên cứu các đặc tính của DNA và RNA đã dẫn đến thực tế là hiện nay có thể sử dụng các axit nucleic này để chẩn đoán bệnh, nghiên cứu gen.
Lấy DNA và RNA
Phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử yêu cầu sự hiện diện của nguyên liệu ban đầu: thường là axit nucleic. Có một số cách để cô lập các chất này khỏi tế bào của sinh vật sống. Mỗi người trong số họ có những ưu và nhược điểm riêng, và nó là cần thiếtlưu ý khi chọn phương pháp phân lập axit nucleic tinh khiết.
1. Lấy DNA theo Marmur. Phương pháp này bao gồm xử lý hỗn hợp các chất với rượu, kết quả là DNA tinh khiết kết tủa. Nhược điểm của phương pháp này là sử dụng các chất mạnh: phenol và cloroform.
2. Phân lập DNA theo Boom. Chất chính được sử dụng ở đây là guanidine thiocyanate (GuSCN). Nó góp phần vào sự kết tủa của axit deoxyribonucleic trên các chất nền chuyên dụng, sau đó nó có thể được thu thập bằng cách sử dụng một chất đệm đặc biệt. Tuy nhiên, GuSCN là một chất ức chế PTC, và ngay cả một phần nhỏ của nó xâm nhập vào DNA kết tủa có thể ảnh hưởng đến quá trình của phản ứng chuỗi polymerase, đóng vai trò quan trọng trong việc hoạt động với axit nucleic.
3. Lắng lắng các tạp chất. Phương pháp này khác với những phương pháp trước ở chỗ không phải các phân tử của axit deoxyribonucleic bị kết tủa mà là các tạp chất. Để làm điều này, thiết bị trao đổi ion được sử dụng. Điểm bất lợi là không phải chất nào cũng có thể kết tủa.
4. Sàng lọc hàng loạt. Phương pháp này được sử dụng trong trường hợp không cần thông tin chính xác về thành phần cấu tạo của phân tử ADN nhưng cần lấy một số dữ liệu thống kê. Điều này được giải thích là do cấu trúc của axit nucleic có thể bị phá hủy khi xử lý bằng chất tẩy rửa, đặc biệt là chất kiềm.
Phân loại phương pháp nghiên cứu
Tất cả các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử được chia thành ba nhóm lớn:
1. Khuếch đại (sử dụng nhiều enzym). Đâyđề cập đến PCR - phản ứng chuỗi polymerase, đóng một vai trò quan trọng trong nhiều phương pháp chẩn đoán.
2. Không khuếch đại. Nhóm phương pháp này liên quan trực tiếp đến hoạt động của hỗn hợp axit nucleic. Ví dụ như 3 đốm màu, kết hợp tại chỗ, v.v.
3. Các phương pháp dựa trên việc nhận biết tín hiệu từ phân tử mẫu dò liên kết với ADN hoặc ARN của mẫu dò cụ thể. Một ví dụ là Hệ thống Chụp Hybride (hc2).
Enzyme có thể được sử dụng trong các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử
Nhiều phương pháp chẩn đoán phân tử liên quan đến việc sử dụng nhiều loại enzym. Dưới đây là những cách thường được sử dụng nhất:
1. Enzyme giới hạn - "cắt" phân tử DNA thành những phần cần thiết.
2. DNA polymerase - tổng hợp phân tử chuỗi kép của axit deoxyribonucleic.
3. Enzyme phiên mã ngược (revertase) - được sử dụng để tổng hợp DNA trên khuôn mẫu RNA.
4. DNA ligase - chịu trách nhiệm hình thành liên kết phosphodiester giữa các nucleotide.
5. Exonuclease - loại bỏ nucleotide từ các phần cuối cùng của phân tử axit deoxyribonucleic.
PCR là phương pháp khuếch đại DNA chính
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được sử dụng tích cực trong sinh học phân tử hiện đại. Đây là một phương pháp trong đó có thể thu được một số lượng lớn các bản sao từ một phân tử DNA đơn lẻ (các phân tử được khuếch đại).
Các chức năng chính của PCR:
- chẩn đoánbệnh;
- nhân bản các đoạn DNA, gen.
Các yếu tố sau đây cần thiết để thực hiện phản ứng chuỗi polymerase: phân tử DNA ban đầu, polymerase DNA có thể điều chỉnh nhiệt (Taq hoặc Pfu), deoxyribonucleotide phosphat (nguồn gốc nitơ), mồi (2 mồi trên 1 phân tử DNA) và bản thân hệ thống đệm, trong đó tất cả các phản ứng đều có thể xảy ra.
PCR bao gồm ba bước: biến tính, ủ lớp sơn lót và kéo dài.
1. Biến tính. Ở nhiệt độ 94-95 độ C, các liên kết hydro giữa hai sợi DNA bị phá vỡ và kết quả là chúng ta nhận được hai phân tử sợi đơn.
2. Ủ lớp sơn lót. Ở nhiệt độ 50-60 độ C, mồi được gắn vào các đầu của phân tử axit nucleic mạch đơn theo kiểu bổ sung.
3. Độ giãn dài. Ở nhiệt độ 72 độ, xảy ra quá trình tổng hợp các phân tử mạch kép con của axit deoxyribonucleic.
giải trình tự DNA
Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử thường yêu cầu kiến thức về trình tự nucleotide trong phân tử axit deoxyribonucleic. Giải trình tự được thực hiện để xác định mã di truyền. Chẩn đoán phân tử trong tương lai sẽ dựa trên kiến thức thu được từ quá trình sắp xếp trình tự của con người.
Các loại trình tự sau được phân biệt:
- Giải trình tự Maxam-Gilbert;
- Sanger trình tự;
- pyrosequencing;
- nanoporegiải trình tự.
