Sự hấp thụ và tiếp tục tái phát ánh sáng của môi trường vô cơ và hữu cơ là kết quả của hiện tượng lân quang hoặc huỳnh quang. Sự khác biệt giữa các hiện tượng là độ dài của khoảng giữa hấp thụ ánh sáng và phát xạ của dòng. Với huỳnh quang, các quá trình này xảy ra gần như đồng thời và với sự phát quang, với một số độ trễ.
Bối cảnh lịch sử
Năm 1852, nhà khoa học người Anh Stokes lần đầu tiên mô tả sự phát huỳnh quang. Ông đặt ra thuật ngữ mới là kết quả của các thí nghiệm của mình với florit, chất này phát ra ánh sáng đỏ khi tiếp xúc với ánh sáng cực tím. Stokes ghi nhận một hiện tượng thú vị. Ông phát hiện ra rằng bước sóng của ánh sáng huỳnh quang luôn dài hơn bước sóng của ánh sáng kích thích.
Nhiều thí nghiệm đã được thực hiện trong thế kỷ 19 để xác nhận giả thuyết. Họ đã chỉ ra rằng một loạt các mẫu phát huỳnh quang khi tiếp xúc với ánh sáng cực tím. Vật liệu bao gồm, trong số những vật liệu khác, tinh thể, nhựa, khoáng chất, chất diệp lục,nguyên liệu làm thuốc, hợp chất vô cơ, vitamin, dầu. Việc sử dụng trực tiếp thuốc nhuộm để phân tích sinh học chỉ bắt đầu vào năm 1930
Mô tả bằng kính hiển vi huỳnh quang
Một số tài liệu được sử dụng trong nghiên cứu trong nửa đầu thế kỷ 20 rất đặc biệt. Nhờ các chỉ số mà phương pháp tương phản không thể đạt được, phương pháp hiển vi huỳnh quang đã trở thành một công cụ quan trọng trong cả nghiên cứu y sinh và sinh học. Kết quả thu được có tầm quan trọng không nhỏ đối với khoa học vật liệu.
Lợi ích của kính hiển vi huỳnh quang là gì? Với sự trợ giúp của các vật liệu mới, người ta đã có thể phân lập các tế bào đặc hiệu cao và các thành phần vi mô. Kính hiển vi huỳnh quang cho phép bạn phát hiện các phân tử riêng lẻ. Nhiều loại thuốc nhuộm cho phép bạn xác định một số nguyên tố cùng một lúc. Mặc dù độ phân giải trong không gian của thiết bị bị giới hạn bởi giới hạn nhiễu xạ, do đó, phụ thuộc vào các đặc tính cụ thể của mẫu, việc phát hiện các phân tử dưới mức này cũng khá khả thi. Các mẫu khác nhau thể hiện hiện tượng tự phát huỳnh quang sau khi chiếu xạ. Hiện tượng này được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp hóa dầu, thực vật học, chất bán dẫn.
Tính năng
Việc nghiên cứu các mô động vật hoặc vi sinh vật gây bệnh thường phức tạp do quá trình tự phát huỳnh quang không đặc hiệu quá yếu hoặc quá mạnh. Tuy nhiên, giá trị trongnghiên cứu thu được việc đưa vào vật liệu của các thành phần được kích thích ở một bước sóng cụ thể và phát ra một thông lượng ánh sáng có cường độ cần thiết. Fluorochromes hoạt động như thuốc nhuộm có khả năng tự gắn vào các cấu trúc (vô hình hoặc nhìn thấy được). Đồng thời, chúng được phân biệt bởi độ chọn lọc cao đối với các mục tiêu và năng suất lượng tử.
Kính hiển vi huỳnh quang đã được sử dụng rộng rãi với sự ra đời của thuốc nhuộm tự nhiên và tổng hợp. Chúng có cấu hình cường độ phát xạ và kích thích cụ thể và nhằm vào các mục tiêu sinh học cụ thể.
Xác định các phân tử riêng lẻ
Thông thường, trong điều kiện lý tưởng, bạn có thể ghi lại sự phát sáng của một phần tử duy nhất. Để làm được điều này, ngoài những điều khác, cần đảm bảo nhiễu máy dò và nền quang học đủ thấp. Một phân tử fluorescein có thể phát ra tới 300.000 photon trước khi bị phá hủy do quá trình tẩy trắng. Với tỷ lệ thu thập 20% và hiệu quả quy trình, chúng có thể được đăng ký với số lượng khoảng 60 nghìn
Kính hiển vi huỳnh quang, dựa trên điốt quang tuyết lở hoặc nhân electron, cho phép các nhà nghiên cứu quan sát hành vi của các phân tử riêng lẻ trong vài giây và trong một số trường hợp là vài phút.
Khó khăn
Vấn đề quan trọng là khử nhiễu từ nền quang học. Do thực tế là nhiều vật liệu được sử dụng trong việc chế tạo các bộ lọc và thấu kính thể hiện một số hiện tượng tự phát huỳnh quang, những nỗ lực của các nhà khoa học trong giai đoạn đầu đã tập trung vào việc phát hànhcác thành phần có độ phát huỳnh quang thấp. Tuy nhiên, các thí nghiệm sau đó đã dẫn đến những kết luận mới. Đặc biệt, kính hiển vi huỳnh quang dựa trên phản xạ toàn phần bên trong đã được tìm thấy để đạt được nền thấp và công suất ánh sáng kích thích cao.
Cơ chế
Nguyên tắc của kính hiển vi huỳnh quang dựa trên phản xạ toàn phần bên trong là sử dụng sóng phân rã nhanh hoặc không lan truyền. Nó phát sinh tại mặt phân cách giữa các phương tiện có chiết suất khác nhau. Trong trường hợp này, chùm sáng đi qua một lăng kính. Nó có chỉ số khúc xạ cao.
Lăng kính tiếp giáp với dung dịch nước hoặc kính thông số thấp. Nếu hướng chùm ánh sáng vào nó một góc lớn hơn góc tới hạn thì chùm sáng bị phản xạ hoàn toàn khỏi mặt phân cách. Hiện tượng này, đến lượt nó, làm phát sinh một làn sóng không lan truyền. Nói cách khác, một trường điện từ được tạo ra xuyên qua môi trường có chiết suất thấp hơn ở khoảng cách nhỏ hơn 200 nanomet.
Trong một làn sóng không lan truyền, cường độ ánh sáng sẽ khá đủ để kích thích các fluorophores. Tuy nhiên, do độ sâu đặc biệt nông, khối lượng của nó sẽ rất nhỏ. Kết quả là nền cấp thấp.
Sửa đổi
Kính hiển vi huỳnh quang dựa trên phản xạ toàn phần bên trong có thể được thực hiện với khả năng chiếu sáng sớm. Điều này yêu cầu thấu kính có khẩu độ số tăng lên (ít nhất là 1,4, nhưng mong muốn là đạt 1,45-1,6), cũng như trường được chiếu sáng một phần của thiết bị. Sau đó đạt được với một điểm nhỏ. Để có độ đồng đều cao hơn, một vòng mỏng được sử dụng, qua đó một phần của dòng chảy bị chặn lại. Để có được góc tới hạn mà sau đó xảy ra phản xạ toàn phần, cần có mức khúc xạ cao của môi trường ngâm trong thấu kính và kính che kính hiển vi.
