Nhuộm Gram được sử dụng rộng rãi trong vi sinh vật học vì đây là một trong những cách dễ nhất để phân biệt vi khuẩn dựa trên thành phần của thành tế bào của chúng. Theo Gram, tất cả các vi khuẩn có thể được chia thành gram dương (Gram (+)) và gram âm (Gram (-)). Phương pháp nhuộm Gram được phát triển vào năm 1884 và không bị mất đi tính phổ biến kể từ đó, mặc dù nó đã được sửa đổi nhiều lần.
Cấu trúc thành tế bào
NhuộmGram cho biết vi khuẩn là Gram dương hay Gram âm. Sự phân chia của vi khuẩn thành Gram (+) và Gram (-) được thực hiện phù hợp với cấu trúc của thành tế bào của chúng.
Thành tế bào chứa một lượng lớn nhất peptidoglycan (murein) - một chất phức tạp, bao gồm peptapeptide và glycan. Glycan bao gồm các gốc xen kẽ của N-acetylglucosamine và N-acetylmuramic axit được liên kết với nhau bằng β-1,Liên kết 4-glycosidic. Peptidoglycan cung cấp chức năng duy trì hình dạng tế bào, bảo vệ thẩm thấu và kháng nguyên.
Sự khác biệt chính giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm
Các vi khuẩn khác nhau có độ dày lớp peptidoglycan khác nhau. Ở vi khuẩn được phân loại là gram dương, nó dao động từ 15 đến 80 nm, trong khi ở vi khuẩn gram âm là từ 2 đến 8 nm. Đồng thời, vi khuẩn Gram âm có cấu trúc đặc biệt dưới lớp peptidoglycan, mà vi khuẩn Gram dương không có - không gian ngoại chất. Không gian này chứa đầy các enzym thủy phân - β-lactamase, ribonuclease 1, phosphatase. Chính những enzym này là nguyên nhân gây ra sự đề kháng của vi khuẩn Gram âm với nhiều loại kháng sinh.
Lớp vi khuẩn Gram (-) peptidoglycan liên kết với lipopolysaccharide, một cấu trúc kháng nguyên có chứa nội độc tố. Ở vi khuẩn Gram (+), axit teichoic thực hiện các chức năng tương tự.
Vi khuẩn gram âm có cấu trúc bổ sung - màng ngoài.
Bản chất của phương pháp nhuộm
Trước khi bạn bắt đầu nhuộm, các vết bẩn của vi khuẩn được nghiên cứu sẽ được chuẩn bị. Để làm điều này, người ta nhỏ nước lên lam kính và cấy vi sinh vật vào đó với vòng vi khuẩn. Sau đó, sau khi nước đã khô hoàn toàn, vết bẩn được cố định - lam kính được đưa qua ngọn lửa đốt nhiều lần. Nhuộm Gram hiệu quả hơn nhuộm vi khuẩn sống - các phân tử thuốc nhuộm liên kết tốt hơn với tế bào chết.
Tô màu được thực hiện theo nhiều giai đoạn:
- Những mẩu giấy lọc nhỏ được đặt trên một vết bẩn cố định và thuốc nhuộm chính được đổ vào - tím gentian hoặc xanh metylen.
- Sau 3-5 phút, lấy giấy lọc màu ra và lấp đầy vết bẩn bằng dung dịch Lugol trong 1 phút. Trong trường hợp này, việc chuẩn bị sẽ tối đi.
- Dung dịch Lugol được làm cạn và xử lý vết bẩn bằng cồn etylic nguyên chất: nhỏ vài giọt lên chế phẩm, để ráo sau 20 giây. Quy trình được lặp lại 2-3 lần.
- Tráng lam thử bằng nước cất.
- Tạo màu nhuộm bổ sung - kết thúc quá trình chuẩn bị với fuchsin. Sau 1-2 phút, thuốc nhuộm được rửa sạch.
- Sau khi nước khô, kiểm tra vết bẩn dưới kính hiển vi. Vi khuẩn Gram dương sẽ có màu xanh tím, vi khuẩn Gram âm sẽ có màu hồng hoặc đỏ.
Nguyên nhân của các kiểu nhuộm khác nhau
Như đã mô tả ở trên, vi khuẩn Gram nhuộm màu vi khuẩn Gram dương có màu xanh tím, trong khi vi khuẩn Gram âm nhuộm màu đỏ hoặc hồng. Lý do cho sự phân biệt nhuộm vi khuẩn bằng phương pháp này là sau khi ở dạng hòa tan của thuốc tím gentian xâm nhập vào tế bào, thuốc nhuộm chuyển sang dạng iốt không hòa tan. Trong quá trình xử lý vi khuẩn bằng cồn etylic, lipid được tách ra khỏi màng dưới tác dụng của dung môi không phân cực này. Khi đó màng trở nên xốp và không còn là rào cản đáng kể đối với quá trình rửa trôi thuốc nhuộm. Tuy nhiênpeptidoglycan bền hơn với các dung môi không phân cực, kể cả rượu. Chính anh ta là người ngăn cản việc rửa sạch thuốc nhuộm, vì vậy vi khuẩn có lớp murein dày sẽ chuyển sang màu xanh tím (gram dương), và sau khi xử lý bằng cồn chúng không đổi màu.
Lớp murein mỏng của vi khuẩn gram âm không thể giữ các phân tử thuốc nhuộm trong tế bào, vì vậy sau tác dụng của rượu, chúng trở nên không màu - nhuộm gram âm.
Sau khi vết bẩn tiếp xúc với fuchsin, vi khuẩn nhuộm Gram vẫn có màu tím xanh, trong khi vi khuẩn Gram âm trở thành màu đỏ hồng.
Ví dụ về vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)
Vi khuẩn Gram âm bao gồm vi khuẩn lam, vi khuẩn lưu huỳnh, vi khuẩn sắt, vi khuẩn chlamydia, vi khuẩn rickettsia, vi khuẩn acetic, nhiều vi khuẩn methylobacteria, vi khuẩn thionic, vi khuẩn arsenitobacteria, vi khuẩn carboxybacteria.
Bifidobacteria, nhiều vi khuẩn thủy sinh, liên cầu và tụ cầu Gram dương.
