Điều gì làm cơ sở cho lai DNA? Mặc dù trình tự DNA sợi đôi thường ổn định trong các điều kiện sinh lý, nhưng việc thay đổi các điều kiện này trong phòng thí nghiệm (thường là bằng cách tăng nhiệt độ môi trường) sẽ khiến các phân tử tách ra thành các sợi riêng lẻ. Các trình tự sau bổ sung cho nhau, nhưng cũng có thể bổ sung cho các trình tự khác có trong môi trường của chúng. Giảm nhiệt độ môi trường xung quanh cho phép các phân tử sợi đơn ủ hoặc "lai" với nhau. Đây là phương pháp lai DNA.
Khái niệm theo quan điểm của sinh học phân tử
Các nhà khoa học tham gia vào cả quá trình sao chép DNA và phiên mã DNA thành RNA đều dựa vào các phép lai nucleotide và kỹ thuật sinh học phân tử. Điều này bao gồm các khối phía Nam và phía Bắc, phản ứng chuỗi polymerase (PCR), và hầu hết các phương pháp lai DNA-RNA và giải trình tự.
Đơn
Lai ghép là đặc tính chính của nucleotidetrình tự và được sử dụng trong nhiều phương pháp sinh học phân tử. Mối quan hệ di truyền tổng thể của hai loài có thể được xác định bằng cách lai các đoạn DNA của chúng (lai DNA-DNA). Do sự tương đồng về trình tự giữa các sinh vật có quan hệ họ hàng gần, nhiệt độ cao hơn được yêu cầu để làm tan chảy các DNA lai như vậy so với các sinh vật ở xa hơn. Nhiều phương pháp khác nhau sử dụng phép lai để xác định nguồn gốc của mẫu DNA, bao gồm cả phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Trong một phương pháp khác, các chuỗi DNA ngắn được lai với mRNA của tế bào để xác định các gen biểu hiện. Các công ty dược phẩm đang khám phá việc sử dụng ARN antisense để liên kết với mRNA không mong muốn, ngăn chặn ribosome dịch mRNA thành protein.
Lai ghép DNA-DNA thường đề cập đến một kỹ thuật sinh học phân tử đo lường mức độ giống nhau về mặt di truyền giữa các nhóm trình tự DNA. Nó thường được sử dụng để xác định khoảng cách di truyền giữa hai sinh vật. Nó đã được sử dụng rộng rãi trong phát sinh loài và phân loại học.
Phương pháp
DNA từ một sinh vật được đánh dấu, sau đó trộn với DNA không được gắn nhãn có thể được so sánh với nó. Hỗn hợp này được ủ để cho phép các sợi DNA phân ly và sau đó làm lạnh để tạo thành DNA sợi kép lai tái sinh. Các trình tự đã lai hóa có mức độ giống nhau cao sẽ liên kết chặt chẽ hơn và cần nhiều năng lượng hơn để tách chúng: tức là chúng tách ra khi được nung ở nhiệt độ cao hơnnhiệt độ so với các trình tự khác nhau, một quá trình được gọi là "tan chảy DNA".
tan chảy DNA
Đánh giá cấu hình tan chảy của DNA lai, DNA sợi đôi được liên kết với cái gọi là "cột" và hỗn hợp thu được được đun nóng. Ở mỗi bước, cột được rửa sạch và các trình tự DNA tan chảy trở thành sợi đơn và rửa sạch cột. Nhiệt độ tại đó DNA được đánh dấu ra khỏi cột phản ánh mức độ giống nhau giữa các trình tự (và mô hình tự gấp đóng vai trò kiểm soát). Các kết quả này được kết hợp để xác định mức độ giống nhau về mặt di truyền giữa các sinh vật. Theo vi sinh vật học hiện đại, không thể lai DNA nếu không hiểu những điều này.
Khi nhiều loài axit ribonucleic (hoặc axit deoxyribonucleic) được so sánh theo cách này, các giá trị tương đồng cho phép các loài được xếp vào cây phát sinh loài. Do đó, đây là một trong những cách tiếp cận khả thi để tiến hành hệ thống hóa phân tử. Charles Sibley và John Ahlquist, những người tiên phong của kỹ thuật này, đã sử dụng phép lai DNA-DNA để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của chim (đơn vị phân loại Sibley-Ahlquist) và động vật linh trưởng.
Tầm quan trọng đối với sinh học
LaiDNA-DNA là tiêu chuẩn vàng để phân biệt các loài vi khuẩn, với giá trị tương đồng hơn 70%, cho thấy các chủng được so sánh thuộc các loài khác nhau. Vào năm 2014, ngưỡng tương tự 79% đã được đề xuất để tách một phân loài vi khuẩn.
Các nhà phê bình cho rằng kỹ thuật này không chính xác để so sánh các loài có quan hệ họ hàng gần, vì bất kỳ nỗ lực nào nhằm đo lường sự khác biệt giữa các trình tự tương đồng giữa các sinh vật đều bị lấn át bởi sự lai tạp của các giống tương đồng trong bộ gen của một sinh vật. Giải mã trình tự DNA và so sánh trình tự tính toán hiện là phương pháp thường được sử dụng để xác định khoảng cách di truyền, mặc dù phương pháp này vẫn được sử dụng trong vi sinh vật học để giúp xác định vi khuẩn.
Cách hiện tại là tiến hành lai DNA-DNA trong silicone bằng cách sử dụng bộ gen được giải trình tự một phần hoặc đầy đủ. GGDC do DSMZ phát triển là công cụ chính xác nhất được biết đến để tính toán các giá trị giống DDH. Trong số các cải tiến thuật toán khác, nó giải quyết vấn đề với các trình tự tương tự bằng cách lọc cẩn thận chúng ra khỏi các điểm trùng khớp giữa hai trình tự bộ gen.
FISH method
Lai ghép huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một kỹ thuật trong phòng thí nghiệm được sử dụng để phát hiện và trình tự DNA, thường là trên một nhiễm sắc thể cụ thể.
Năm 1969, Joseph Gall và Mary Lou Pardu đã xuất bản một bài báo chứng minh rằng các bản sao phóng xạ của chuỗi DNA ribosome có thể được sử dụng để phát hiện chuỗi DNA bổ sung trong nhân trứng ếch. Kể từ những quan sát ban đầu này, nhiều cải tiến đã làm tăng tính linh hoạt vàĐộ nhạy của quy trình đến mức lai tại chỗ ("tại chỗ", tiếng Latinh) hiện được coi là một công cụ quan trọng trong di truyền tế bào. (Thuật ngữ tại chỗ bây giờ cũng được sử dụng để chỉ giai đoạn đầu của sự phát triển ung thư biểu mô, khi chỉ có mô biểu mô tham gia vào quá trình bệnh lý.)
Trình tự lai huỳnh quang
Đầu dò
RNA có thể được thiết kế cho bất kỳ gen nào hoặc bất kỳ trình tự nào trong gen để hình dung mRNA lncRNA và miRNA trong mô và tế bào. FISH được sử dụng bằng cách nghiên cứu chu kỳ sinh sản của tế bào, đặc biệt là giữa các giai đoạn hạt nhân cho bất kỳ bất thường nhiễm sắc thể nào. FISH cho phép bạn phân tích một loạt các trường hợp lưu trữ, việc xác định nhiễm sắc thể đã được xác định sẽ dễ dàng hơn nhiều bằng cách tạo một mẫu dò với cơ sở nhiễm sắc thể nhân tạo sẽ thu hút các nhiễm sắc thể tương đồng.
Tín hiệu lai cho mỗi đầu dò khi phát hiện bất thường về hạt nhân: mỗi đầu dò phát hiện mRNA và lncRNA bao gồm 20 cặp oligonucleotide, mỗi cặp bao phủ một không gian 40-50 bp. p. Đầu dò sử dụng hóa học độc quyền để phát hiện mRNA.
Lai ghép với đầu dò DNA
Đầu dò thường được tạo ra từ các đoạn DNA đã được phân lập, tinh chế và khuếch đại để sử dụng trong thiết kế bộ gen người. Kích thước của bộ gen người quá lớn so với chiều dài có thể được giải trình tự trực tiếp nên cần phải chia thànhmảnh vỡ. Cuối cùng, các mảnh này được sắp xếp thứ tự bằng cách phân tách bản sao của mỗi mảnh thành các đơn vị thậm chí còn nhỏ hơn bằng cách sử dụng endonucleaza cụ thể cho trình tự để đo kích thước của từng mảnh nhỏ bằng sắc ký loại trừ kích thước sử dụng thông tin này để xác định vị trí các mảnh lớn chồng lên nhau.
Để bảo toàn các nguyên tố với trình tự DNA riêng lẻ của chúng, các đoạn này đã được thêm vào một hệ thống các quần thể vi khuẩn lặp đi lặp lại. Các quần thể vi khuẩn vô tính, mỗi quần thể duy trì một nhiễm sắc thể nhân tạo duy nhất, được lưu trữ trong các phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới. Nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC) có thể được nuôi cấy, chiết xuất và dán nhãn trong bất kỳ phòng thí nghiệm nào có thư viện. Các thư viện bộ gen thường được đặt tên theo các tổ chức nơi chúng được phát triển. Một ví dụ là thư viện RPCI-11, được đặt theo tên của Viện Ung thư Roswell ở Buffalo (New York, Mỹ). Những mảnh vỡ này tạo nên khoảng 100 nghìn cặp bazơ và là cơ sở của hầu hết các đầu dò FISH.
